代谢综合征与心血管疾病相关，一定程度上是因为引起了动脉硬化。高脂高糖饮食是代谢综合征的重要诱发因素，当前，他汀类降脂药对于动脉硬化的改善效果并不理想。因此，阐明代谢综合征导致动脉硬化的分子机制对于减少或预防后续的心血管相关疾病有重要意义。
今年，天津医科大学基础医学院艾玎教授课题组在Circultion Research（中科院JCR一区，IF：23.213 ）上发表了题为“YAP Targets the TGFβ Pathway to Mediate High-Fat/High-Sucrose Diet-Induced Arterial Stiffness”的文章，揭示了平滑肌细胞YAP分子在高脂高糖饮食诱导的动脉硬化中的作用和分子机制，为相关心血管疾病的治疗提供了新的思路和靶点。
研究结果
1. 高脂高糖饮食诱导小鼠动脉硬化
研究者将8周龄雄性小鼠随机分为两组，并分别喂食高脂高糖食物（HFHS）和正常食物（ND），8周后检测动脉血管变化。与ND组相比，HFHS组小鼠主动脉和颈动脉的脉搏波速度和胶原含量均显著上升，而血压在两组间相似。TGFβ已被证明是组织纤维化和细胞外基质产生的最重要的调控因子之一，因此，研究者检测了TGFβ/Smad信号通路的激活。检测结果表明，与ND小鼠相比，磷酸化Smad2/3的水平在HFHS组小鼠的主动脉中膜中显着升高。
2. 4D蛋白质组学筛选关键蛋白
为了进一步揭示高脂高糖饮食诱导的TGFβ通路激活的机制，研究者对小鼠主动脉中膜（主要由血管平滑肌细胞（VSMC）组成，HFHS（n=3）vs. ND（n=3）)进行4D蛋白质组学检测。4D蛋白质组学共定量了2543个蛋白，其中341个上调蛋白，343个下调蛋白（fc＞1.5，p＜0.05）。差异上调蛋白的KEGG分析显示了ECM受体相互作用和TGFβ信号通路及胆固醇和甘油脂代谢途径相关通路在HFHG小鼠主动脉中的富集。该结果表明已构建的小鼠模型与代谢紊乱诱导的动脉硬化相一致。研究者注意到，差异上调蛋白中存在一个与动脉硬化相关的蛋白——YAP。
研究者对YAP蛋白的表达情况进行验证，发现在HFHS组小鼠中，YAP蛋白总体表达量上调，同时细胞核和细胞质中的YAP水平均上升，而YAP的细胞核比细胞质的比率降低。该结果意味着，血管平滑肌细胞（VSMC）中YAP蛋白的高表达在高脂高糖诱导的动脉硬化中有重要作用。
3. YAP蛋白随时间的变化
研究者对高脂高糖喂食小鼠不同时间点YAP蛋白的变化进行检测，发现在早期（第二周）YAP蛋白的表达量即呈现明显的上调，磷酸化YAP在第二周出现明显上调，而在第八周则下调。研究者检测了第二周时YAP mRNA的表达水平，发现HFHS组和ND组的YAP mRNA表达量相当。这意味着，YAP的上调并不发生在转录水平上，而是在蛋白水平上。此外，HFHS组的总YAP和磷酸化YAP水平均显著高于ND组。
考虑到mTORC1在过量营养摄入时会被激活，研究者的结果也表明在HFHS组中mTORC1活性增强。研究者在人动脉血管平滑肌细胞中使用siRNA抑制mTORC1，发现当mTORC1被抑制后，诱导了细胞自噬和YAP蛋白表达的下调，而这种作用在自噬抑制剂处理后得以恢复。此外，使用mTORC1抑制剂处理也会显著降低YAP蛋白表达。综合这些结果，研究者认为，高脂高糖饮食诱导的mTORC1激活导致的YAP表达上调是通过降低主动脉中膜的细胞自噬实现的。
有趣的是，脂肪、组织、肝和心脏组织中YAP的mRNA和蛋白水平并未受到高糖高脂饮食的影响，这意味着高脂高糖特异性诱导了血管中YAP蛋白的上调。
4. YAP蛋白在HFHS（高脂高糖）诱导的动脉硬化中有重要作用
研究者构建了平滑肌细胞特异性敲低YAP的小鼠模型，在高脂高糖饮食8周后，检测血管硬化度。在喂食HFHS时，YAP敲低和未敲低组之间的附睾脂肪质量与体重的比率、血浆总胆固醇和甘油三酯水平、葡萄糖耐受和血压均无显著区别。YAP敲低组的动脉硬化不显著，但有显著更低的胶原蛋白聚集。此外，YAP敲低组的总YAP、磷酸化YAP、磷酸化Smad2和Smad3都较低。该结果表明，平滑肌细胞特异性敲低YAP能减轻高脂高糖（HFHS）诱导的动脉硬化。
5. YAP通过PPM1B依赖的机制在平滑肌细胞的TGFβ通路中发挥重要作用
为了研究YAP在TGFβ通路中的作用，研究者对人动脉平滑肌细胞（HASMC）进行了YAP的敲低和过表达。在TGFβ处理条件下，磷酸化Smad2/3在1h处达到峰值，随后在2h开始降低，而YAP敲低组磷酸化Smad2/3都较对照组显著低。在YAP过表达组，磷酸化Smad2/3都显著升高。TGFβ诱导的Smad2的核定位以及ECM相关基因的mRNA表达在YAP敲低后均下调，而在YAP过表达后均上调。这些结果表明了一种YAP相关的激酶或磷酸酶调控了磷酸化Smad2/3的水平。
研究者通过进一步的实验确认YAP过表达可以减缓Smad2/3的去磷酸化，并通过anti-FLAG-YAP CO-IP实验和GST-PRM1B pull-down实验确认了参与去磷酸化的磷酸酶为PPM1B。
为了进一步探索PPM1B对Smad2/3的去磷酸化作用，研究者在HASMC（人动脉平滑肌细胞）中敲低或过表达PPM1B。发现在TGFβ处理的条件下，敲低PPM1B显著上调磷酸化Smad2/3，而过表达PPM1B则显著下调磷酸化Smad2/3。进一步，为了确认PPM1B对Smad2/3的去磷酸化是否是通过PPM1B的磷酸化活性来实现的，作者在HEK 293T细胞中表达TβR1 T204D（TGFβ受体1，204位苏氨酸（T）突变为天冬氨酸（D），磷酸化激活型突变，该突变使TβR1 处于稳定的模拟磷酸化状态，可持续磷酸化其底物Smad2/3，使之激活）。在表达TβR1 T204D的细胞中，野生型PPM1B可降低 Smad2/3的磷酸化，而磷酸酶活性失活型PPM1B（R179G，179位精氨酸（R）突变为甘氨酸（G））则不能降低Smad2/3的磷酸化。该结果表明，PPM1B对Smad2/3的去磷酸化依赖于PPM1B的磷酸酶活性。
接下来，研究者探究了YAP蛋白调控PPM1B依赖的Smad的去磷酸化。PPM1B过表达可以降低TGFβ1诱导的磷酸化Smad2的生成以及TβR1 T204D诱导的Smad2-Smad4复合体的形成。这两种作用均可被YAP过表达逆转。研究者同时发现，在PPM1B缺失的HASMC（人动脉平滑肌细胞）中，TGFβ1诱导的磷酸化Smad2/3的水平显著升高，且YAP过表达无法进一步使Smad2/3磷酸化水平升高。该结果表明，YAP对磷酸化Smad2/3的作用依赖于PPM1B。
6. YAP抑制TGFβ诱导的PPM1B泛素化和核易位
内源性PPM1B主要位于细胞质中，而Smad2/3在细胞核中去磷酸化。因此，研究者假设在TGFβ通路激活条件下，PPM1B发生了核易位。最终的实验结果也证明了研究者的假设：PPM1B在对TGFβ响应时易位到细胞核，执行了TGFβ诱导的磷酸化Smad2/3在细胞核中的去磷酸化，通过这样的负反馈调节保证TGFβ的适当活性。此反馈调节由YAP控制。
翻译后修饰对蛋白的稳定性、定位及构型有重要的影响。在PPM1B上仅报道过蛋白泛素化，因此研究者探索YAP调控PPM1B在细胞质中的停留是否是依赖于PPM1B的泛素化。最终的实验表明，在YAP蛋白封闭了PPM1B K326（326位赖氨酸）的泛素化，随后阻止了PPM1B易位到细胞核，最终减弱了对Smad2/3的去磷酸化。
7. YAP-CC结构域介PPM1B和YAP之间的物理相互作用
研究者进一步探索了YAP与PPM1B结合的结构域。通过表达不同截短的HA-YAP以及全长Myc-PPM1B，并进行pull-down实验检测YAP与PPM1B的结合情况。最终发现，当YAP缺失CC（coiled-coiled motif，卷曲螺旋基序）结构域时，anti-Myc免疫磁珠pull-down的产物中检测不到YAP。随后的实验也表明，CC结构域对YAP与PPM1B的结合是必需的。紧接着，研究者将CC结构域分为coiled-coil区和非coiled-coil区，体外合成这两条肽段并进行pull-down实验，结果发现PPM1B选择性与coiled-coil肽段结合。同样地，研究者也明确了与YAP结合的区域是PPM1B的CD（C-terminal Domain）。研究者进一步将YAP CC结构域的关键氨基酸突变为甘氨酸（YAP-CC-G-mut），该突变废除了YAP与PPM1B的结合，同时也无法增加TGFβ诱导下Smad2/3的磷酸化水平。此外，YAP-CC-G-mut也无法降低PPM1B K326的泛素化。以上结果表明，YAP-CC结构域和PPM1B CD对于TGFβ信号通路激活是非常重要的，因此也预示着它们是高脂高糖诱导的动脉硬化的潜在治疗靶点。
研究者在高脂高糖诱导的动脉硬化症小鼠主动脉中膜中检测到了TGFβ信号通路的激活，通过4D蛋白质组学检测到了YAP蛋白的高表达。鉴于YAP蛋白与动脉硬化有关，研究者进一步探索了YAP在TGFβ信号通路中扮演的角色。最终的结果表明，YAP参与调控TGFβ/Smad2/3信号通路。机制上，YAP可以逆转PPM1B泛素化，阻断其转位入核，最终使之不能将Smad2/3去磷酸化，从而保持了TGFβ信号通路的持续激活。结构上，YAP是通过其CC结构域与PPM1B的CD结合来发挥作用。作者的研究同时提示我们，靶向抑制YAP和PPM1B结合或可作为代谢综合征患者预防动脉硬化的治疗策略。
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