1区，IF=7.561｜曹雪涛院士团队揭秘2’-O-甲基化修饰对先天免疫及病毒感染的影响-技术前沿-资讯-生物在线

2’-O-CH3 修饰，即 2’-O-甲基化修饰，是一种常见于 tRNA、rRNA 和 snRNA 的 RNA 修饰类型。由于这种甲基化修饰（记作“m”）可以发生于 A/U/G/C （记作“N”）中的任何一种核苷酸残基的核糖 2’-OH 上，即可能为 Am/Um/Gm/Cm 中的任意一种，故又被称为“Nm 修饰”。Nm 修饰可增强核苷酸的疏水性，从而影响 RNA 分子的结构和稳定性，进而调节多种生物学过程。近年来，得益于高通量测序技术的普及，mRNA 上的 Nm 修饰现象也得到了逐步揭示。研究发现，mRNA 上的 Nm 修饰常出现于 5’ 帽子结构下游的第 1、2 位核苷酸残基上，在 mRNA 的其它区域也有报道发现。然而，Nm 修饰对于免疫细胞的生理功能有何影响，仍然是一片未知的领域。近期，南开大学校长曹雪涛院士领衔的科研团队发表的论文发现，Nm 甲基化转移酶 FBL 可通过对 mRNA 的 Nm 修饰来促进病毒感染、抑制先天免疫反应。云序生物有幸参与了此项研究中的 2’-O-甲基化修饰测序（Nm-seq ）、mRNA 测序以及数据分析。至此，云序生物服务的客户在RNA修饰研究上面即将实现大满贯，在m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、 2’-O-甲基化修饰均发表高质量文章。

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论文标题：RNA 2’-O-Methyltransferase Fibrillarin Facilitates Virus Entry Into Macrophages Through Inhibiting Type I Interferon Response
发表期刊：Frontiers in Immunology (IF=7.561)
作者院校：南开大学 & 北京协和医学院
研究方法：RNA 修饰质谱LC-MS、2’-O-甲基化修饰测序（Nm-seq ）、mRNA 测序

Nm 修饰示意图

简化版研究思路图

1、病毒感染提升 mRNA 中 Am 修饰的整体水平
研究者首先在 VSV 病毒（Vesicular Stomatitis Virus）感染的小鼠巨噬细胞 RAW264.7 和未感染的对照组细胞中进行了mRNA 修饰质谱LC-MS，发现核糖 2’-OH 上发生甲基化修饰的腺嘌呤残基（Am）的比例在病毒感染后显著上升。研究者进而对 VSV 病毒感染的小鼠巨噬细胞及未感染病毒的对照组细胞进行了 mRNA 的 2’-O-甲基化修饰测序（Nm-seq ），发现了两组细胞之间存在 6808 个差异 Nm 修饰位点（fold change >=4）。基于组间差异 Nm 修饰位点进行的 GO 分析显示，分子功能（MF）差异主要集中于翻译和 RNA 加工，细胞组分（CC）差异主要集中于外泌体、细胞核以及细胞质，生物功能（BP）差异主要集中于核苷酸结合和蛋白质结合等。基于组间差异 Nm 修饰位点进行的 KEGG pathway 分析显示，差异 Nm 修饰基因主要富集于病毒感染相关的通路当中。Nm 修饰位点在基因内区域的统计显示，大部分 Nm 位点位于编码区（CDS）。研究者还对病毒感染组和对照组的 Nm 修饰 motif 进行了分析，发现 Nm 修饰 motif 在病毒感染前后存在差异，说明病毒感染前后可能造成了不同 RNA 分子的丰度改变。以上证据说明，mRNA 的 Nm 修饰可能参与调节病毒感染以及抗病毒免疫过程。

2、Nm 甲基化转移酶 FBL 促进病毒感染
研究者对 8 种 Nm 甲基化转移酶（FTSJ1、FTSJ2、FTSJ3、FBL、CMTR1、CMTR2、MRM1、MRM3）进行了 siRNA 敲降实验的筛选，发现敲降 FBL 可以在 RNA 水平、蛋白质水平以及病毒滴度水平抑制 VSV 病毒对小鼠外周血巨噬细胞的感染。研究者通过查询 GEO 数据库发现，系统性红斑狼疮病人的 CD19+ B 细胞和 CD4+ T 细胞相比于健康对照组，FBL 的表达量显著降低，暗示 FBL 可能具有免疫调节的功能。研究者还换用病毒物种以及宿主物种进行了一系列 FBL 敲降后的病毒感染实验，结果均显示 FBL 具有促进病毒感染的功能。

3、FBL 在感染早期促进 VSV 病毒进入巨噬细胞
Ⅰ 型干扰素（IFN-I）和干扰素刺激基因（Interferon Stimulated Genes, ISGs）在抗病毒先天免疫中扮演重要的角色。然而，当发生 VSV 病毒感染时，在 FBL 敲降的小鼠外周血巨噬细胞中，相比于对照组的细胞，IFN- α、IFN- β 以及 IFN-I 信号通路中的其它分子却并没有显著变化。研究者还发现，FBL 敲降也不影响小鼠外周血巨噬细胞的活性。不过，在 VSV 感染后 0h、4h、7h、10h 针对病毒感染相关蛋白分子的 Western Blot 实验中发现，FBL 敲降可在病毒感染早期抑制 VSV 蛋白的表达。研究者因此进一步进行了 VSV 结合细胞以及进入细胞的检测，发现 FBL 敲降并不影响 VSV 与细胞的结合，但会抑制 VSV 进入细胞。

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4 、FBL 在正常生理条件下抑制 ISGs 在巨噬细胞中的表达
研究者在基因编辑 FBL 敲除杂合子细胞系（Fbl+/-）和对照组细胞（Fbl+/+）做了mRNA 测序（3 vs 3），发现 FBL 敲除细胞中的多个干扰素刺激基因（Interferon Stimulated Genes, ISGs）的表达发生了上调。这种上调现象无需病毒感染作为刺激条件。针对 Ifi44、Oas2、Ifit3、Ddx60、Oasl1、Bst2、Ifit1 等几个 ISGs 的 RT-qPCR 也发现，这些基因的 mRNA 在 FBL 敲降的细胞中表达水平发生上调。
因此，作者认为，FBL 在正常生理条件下扮演了免疫抑制剂的角色。当 FBL 被敲降时，一些抗病毒的免疫基因的表达增加，因此抑制 VSV 病毒进入巨噬细胞。

5 、敲降 FBL 可通过 IFN-I 信号通路提升 ISGs 表达，从而抑制病毒进入细胞
早先的研究显示，IFN-I 可以通过 IFNAR-JAK-STAT 信号通路来诱导 ISGs 的表达。研究者发现，在 IFNAR 沉默的细胞系中，如果再敲降 FBL 的话，将无法提升 ISGs 的表达，也不能抑制 VSV 病毒进入细胞。并且，当人为引入充足的 IFN-β 刺激条件时，即使 FBL 敲降也不能提升 ISGs 的表达水平。综上所述我们可以得出结论：FBL 是通过 IFN-I 信号通路来起到提升 ISGs 表达水平的作用的。

6 、FBL 介导的 RNA 2’-O-甲基化修饰抑制先天免疫系统的激活以及 IFN-I 的表达
研究者在基因编辑 FBL 敲除杂合子细胞系（Fbl+/-）和对照组细胞（Fbl+/+）中进行了 mRNA 修饰质谱LC-MS，发现 FBL 敲除细胞系中的 Am 修饰比例显著下降。FBL 细胞中类似的 Nm 修饰比例下降现象也出现在总 RNA 的修饰质谱检测（5 vs 5）结果当中，且可以被 FBl 过表达载体所逆转。以上证据说明，FBL 催化了 Nm 修饰的发生。
据报道，mRNA 的 5’ 帽子结构上的 Nm 修饰可以用于区分内源 RNA 和外源 RNA：在灵长类细胞和小鼠细胞实验中，缺乏 5’ 帽子结构 Nm 修饰的外源病毒 mRNA 可被细胞识别并弱化（attenuate）。因此，作者推测，在 FBL 敲降的巨噬细胞中，低 Nm 修饰的内源 RNA 可能被误识别为外源 RNA，从而激活先天免疫系统 IFN-I 相关信号的表达。一系列 mRNA 和蛋白质定量检测实验结果都显示，FBL 敲降的巨噬细胞中 IFN-β 以及抗病毒免疫信号通路的一些分子都发生了上调，印证了作者的猜想。

7、FBL 通过 MDA5 介导对 IFN-I 信号和 ISGs 的调控
MDA5 和 RIG-I 都是常见的病毒 RNA 识别分子。研究者分别构建了 MDA5 和 RIG-I 敲除细胞系，并在此基础上进行 FBL 敲降实验，检测 ISGs 的 mRNA 表达水平以及 VSV 进入细胞后的 mRNA 表达水平。实验结果发现，在 MDA5 敲除细胞系中，FBL 敲降处理将不会影响 ISGs 的表达，也不会影响 VSV 进入细胞，说明 FBL 作用于 MDA5 的上游。

小结

综上所述，作者发现 Nm 甲基化转移酶 FBL 可催化包括 mRNA 在内的小鼠巨噬细胞 RNA 发生 Nm 修饰。这种 Nm 修饰水平可被 MDA5 识别检测，如果 FBL 表达受抑制、 Nm 修饰水平降低，则会被 MDA5 解读为外源 RNA 的信号，激活 IFN-I 相关信号，进而促进 ISGs 的表达，引发抗病毒的先天免疫反应。由于病毒感染可以抑制 FBL 的表达，因此最终可以反过来阻止更多病毒进入细胞。

-- 云序生物服务优势 --

单碱基分辨
可对2’-O-甲基化修饰进行单碱基定位。
高通量检测
可对全转录组范围内的2’-O-甲基化修饰位点进行高通量地平行检测。
全分子覆盖
可全面地对mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的2’-O-甲基化修饰位点进行检测。
一站式服务
客户仅需提供组织或细胞，云序生物一站式完成RNA抽提，样品预处理，建库，测序，数据分析全套流程。
专业的生物信息学分析
专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

云序生物RNA修饰研究五大模块

01 RNA修饰测序
云序生物可提供针对m6A、m5C、m1A、m7G、m6Am、ac4C、O8G、Nm 等多种不同的 RNA 修饰类型，对 mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA 等多种类型的 RNA 进行修饰测序。

02 检测整体 RNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平

03 RNA修饰上游酶的筛选
RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控RNA修饰的 Writer/Eraser/Reader 蛋白。

04 RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

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