传统上，环状 DNA 被认为仅存在于原核生物以及部分病毒当中，在真核生物当中，仅有半自主细胞器线粒体和叶绿体当中具有环状 DNA。1964年，伊利诺伊大学的 Yasuo Hotta 和 Alix Bassel 却在小麦的胚和公猪精液当中发现了环状 DNA，证明了这种看似结构怪异的 DNA 在高等植物和哺乳动物中亦存在。从 1960 年代至今的半个多世纪里，研究者已经在几乎所有的物种当中发现环状 DNA 的踪迹。因为这些环状 DNA 存在于染色体之外，因此也得名“染色体外环状 DNA”（ extrachromosomal circular DNA，简称 eccDNA） 。近年来，得益于分离纯化以及测序技术的进步，eccDNA 领域的研究实现了爆炸式的增长。
eccDNA的大小
在有些文献当中，将较小的染色体外环状DNA定义为狭义的 eccDNA，而将较大的染色体外环状DNA定义为 ecDNA。这一分类方法是人为主观分类，大多以10000bp长度为界限。此外，在早期的文献当中，还存在“spcDNA ”（约 100 到 10000 bp）、“microDNA”（ 约200 到 3000 bp）等名词。在云序生物，我们采用 eccDNA 的广义定义，即凡是位于染色体以外的环状 DNA，均可称为 eccDNA。
大量文献报道都发现，eccDNA 的大小长度分布，往往在核小体单位长度（180-200bp）的倍数附近成峰，且长度一般以一千以下的短环为主。这可能与细胞凋亡时产生的 DNA 核小体片段有关系。
孕妇血浆中的 eccDNA 长度分布
图出自“Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma”
eccDNA的数目
eccDNA 在各类物种、各类组织当中几乎都可以检测到。虽然在不同类型的样品中存在一定的异质性，但大体来说，常见物种的组织细胞样品当中，单个样品中往往可以检出数千到数万种不同的 eccDNA。
样品中 eccDNA 的数目及 eccDNA 上基因的数目
图来自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”
eccDNA上的基因
虽然在不同类型的样品中存在一定的异质性，但大体来说，由于 eccDNA 长度普遍较短，多数 eccDNA 并不包含完整的基因序列。对于含有完整基因序列的 eccDNA，其中含有1个基因的最多，而含有2个、3个、4个基因的 eccDNA 则有依次递减的趋势。
eccDNA 上含有的基因个数的分布情况
图来自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”
eccDNA在染色体上的分布特征大量文献报道都发现，eccDNA 广泛来源于各条染色体。在对于人类而言，基因密度高的 17、19 号染色体上的 eccDNA 密度也较高；而基因密度低的 X、Y 染色体上，eccDNA 密度则较低。
eccDNA 在人类染色体上的分布特征
图来自“Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue”
eccDNA成环位点附近的motif特征虽然学界目前没有公认的描述，但 eccDNA 成环位点附近的核酸序列是存在一定的规律特征的。有一些论文当中分析了成环位点附近的 motif 特征，从结果上来看，存在一定的相似性。关于 eccDNA 成环位点附近的 motif 特征的具体结论还有待未来的研究进一步阐明。eccDNA 成环位点附近的 motif 特征
上方图来自“Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma”
下方图来自 “Circle-Seq reveals genomic and disease-specific hallmarks in urinary cell-free extrachromosomal circular DNAs”
eccDNA的细胞内外的分布
eccDNA 虽然主要分布于细胞核，但在细胞质中也有发现。此外，即使是在外泌体、血液、尿液等细胞外场所，也有 eccDNA 存在（往往是较小的环），这可能是因为 eccDNA 环状结构相对稳定，在细胞外也不易被降解。eccDNA的形成
eccDNA 的形成机制，至今仍然停留在假说阶段，没有通用的、公认的模型。目前的研究普遍认为，eccDNA 的形成与染色体DNA的损伤及修复密切相关，因此，具体的 eccDNA 形成机制取决于染色体 DNA 的损伤发生形式以及修复方法。下面介绍几种主流的 eccDNA 形成机制的假说：
1.双链断裂（DSBs）假说
在同一条染色体上，如果发生两处双链断裂，则脱落下来的一段 DNA 有可能在错配修复（Mismatch repair，简称MMR）或非同源末端修复（Nonhomologous end joining，简称NHEJ）机制作用下成环。多个不同来源的 DNA 片段也有可能形成嵌合的环状 DNA。支持这一假设的直接证据，有 2018 年发表在Nulceic Acid Research 上的
这篇论文，通过 CRISPR 技术在同一染色体上人为制造两处双链断裂，直接验证了 eccDNA 可由双链断裂产生。
2.染色体碎裂（Chromothripsis ）假说
在癌症中，大规模的DNA损伤导致的染色体碎裂，可以作为 eccDNA 的一个来源。染色体碎裂涉及多个DNA双链断裂，将整条染色体碎片化。2020 年发表在 Nature 上的这篇论文认为，染色体碎裂是癌症中 eccDNA 的主要来源。
3.断裂-融合-桥（breakage–fusion–bridge ，简称 BFB）假说
“断裂-融合-桥”循环始于一条染色体的双链断裂，使该染色体失去了一个端粒。缺乏端粒的染色体末端可以融合形成一个拥有两个着丝粒的染色体。到了减数分裂后期，双着丝粒染色体将会被拉开，形成染色体桥，随后染色体桥断裂，产生各种染色体畸变，这其中的产物就可能包括 eccDNA。虽然早期的研究者将 BFB 机制单列为一个 eccDNA 的产生机制，但近来的研究倾向于认为 BFB 可能是通过染色体碎裂来生成 eccDNA 的。
eccDNA 形成机制的三类假说
图来自“Extrachromosomal circular DNA in cancer: history, current knowledge, and methods”
eccDNA的维持和分布
1980年代的早期研究显示，eccDNA 可能在每次有丝分裂周期中都会复制，但由于缺乏着丝粒，所以无法在有丝分裂中均匀分布到子细胞当中。因此，这种不均匀的 eccDNA 分配，将赋予一部分子细胞更强的生存和增殖能力，给癌症的发展提供丰富的可能性。已有多篇文献报道显示，EGFR、MYC、MYCN 等肿瘤相关基因在肿瘤样品以及抗药性细胞样品中的 eccDNA 上普遍存在。2022 年发表在 Cancer Discovery 上的这篇论文用一种名为 ecTag 的荧光技术标记了 eccDNA 的成环位点，从而可以观察 eccDNA 的真实分布，为 eccDNA 在有丝分裂时的不均匀分配提供了直接的实验证据。尽管如此，eccDNA 究竟是如何在细胞中维持复制的，至今仍然是一个很有争议的问题。由于 eccDNA 大部分长度较短，其上很可能缺乏复制起点（ Replication origin），无法进行 DNA 复制。目前，学界还不清楚这些 eccDNA 水平的提高是复制扩增的结果还是因为 eccDNA 生物生成水平的提升。eccDNA的定量分析
目前，并无文献报道使用 qPCR 的方式来测定 eccDNA 的含量。然而，通过全基因组测序（WGS）或单核苷酸多态性分析的芯片测试获取到的拷贝数异变（CNV），可以间接反应 eccDNA 拷贝数的升高。
eccDNA的已知功能
eccDNA 的生物学功能是极其丰富的。目前已经明确的功能至少有以下这些类型：1.抗药性：例如赋予植物的抗除草剂能力，或赋予肿瘤细胞以耐受化疗药的能力。2.功能增强：例如，在肌肉当中，含有 TTN 基因的 eccDNA 的表达水平上升，可能可以表达更多的肌联蛋白（titin）。3.衰老：在酵母、果蝇以及小鼠的研究中都有发现，eccDNA 随着年龄的增加而积累；然而，在人类精细胞当中，eccDNA 的含量却与年龄存在相反的关联关系，在年轻样品当中反而具有更高的 eccDNA 含量。因此，eccDNA 与衰老之间的关系还有待进一步研究和总结。4.维持基因组稳定性：有一类特殊的 eccDNA 具有维护端粒稳定性的功能，即“t-circle”。5.免疫功能：eccDNA 可能因为其弯曲的环状空间结构（而非核酸序列特征），而起到激发先天免疫的作用。云序生物对此项研究进行过详细解读，点击链接即可查看。6.细胞间通讯：由于 eccDNA 环状结构的稳定性，所以 eccDNA 在血液、外泌体等细胞间结构中广泛存在，有可能通过细胞再摄入而起到细胞间通讯的作用。可以想像，eccDNA 还有很多生物学功能待进一步发现和总结。eccDNA研究项目如何更上一层楼
囿于目前研究手段的限制，我们并不能单独对 eccDNA 进行类似于基因组 DNA 那样的基因敲除/敲降处理，也难以针对单个的 eccDNA 进行过表达实验。因此，eccDNA 的研究项目，在完成了 eccDNA 测序实验后，确实难以进一步开展分子机制的研究。
然而，我们还是有办法在 eccDNA 谱的基础上，更上一层楼做一些进阶的研究的。常见的思路是多组学联合分析，例如 eccDNA-mRNA 联合分析、eccDNA-miRNA 联合分析 、eccDNA-RNA m6A 修饰联合分析、eccDNA-WGS 联合分析等。
eccDNA-mRNA 联合分析案例
图来自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”
此外，针对 eccDNA 上的 5mC 甲基化修饰，我们还能开展环状DNA甲基化测序， 在的提供 eccDNA 谱的基础上额外实现单碱基精度的甲基化修饰检测。该方案利用酶学方法实现 C 到 T 的温和转化，并保留 5mC 修饰的碱基不变，从而在 eccDNA 测序的基础上额外给出 eccDNA 甲基化的数据，实现一箭双雕的效果。不同长度的 eccDNA 的相对丰都及甲基化修饰水平分布图
图来自“Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance”
此外，也有学者通过 eccDNA 结构疏松的特点，利用 ATAC-seq 技术实现了对 eccDNA 的检测。该方案无需对 eccDNA 进行滚环扩增，可能有利于避免不同大小 eccDNA 滚环扩增效率不同所带来的定量差异。利用 ATAC-seq 技术实现对 eccDNA 的检测
图来自“ATAC-Seq-based Identification of Extrachromosomal Circular DNA in Mammalian Cells and Its Validation Using Inverse PCR and FISH”
无论如何，通过高通量测序实验找出少数几个感兴趣的 eccDNA 后，我们还需要对其进行低通量的验证实验，以确保该 eccDNA 在样品当中的真实存在。常见的 eccDNA 验证实验方法有针对成环位点的反式 qPCR（Inverse qPCR 或 Outward-facing qPCR）和Sanger 测序。通过 Sanger 测序和反式 PCR 验证 eccDNA 成环位点的真实性
图来自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”
总之，虽然目前 eccDNA 的研究手段比较有限，但仍然可以结合其他实验方法，拓展 eccDNA 研究项目的广度。多组学联合分析、eccDNA 自身的甲基化研究、eccDNA 验证是目前常见的几类拓展研究思路。云序生物eccDNA测序
云序生物是国内最早提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年，云序率先发布了
组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio独家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了
体液样品环状DNA测序及体液样品环状DNA甲基化测序，均为全国首发，并成为国内环状DNA产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021年，云序生物的客户率先发表国内首批 eccDNA 研究论文，其中更有
发表于 Nature Communications 上的高分研究。
组织细胞环状 DNA 测序
体液样品环状DNA 测序
体液样品环状DNA 甲基化测序
环状DNA Sanger 测序验证
A&A Biotechnology 环状DNA 纯化柱
1.组织细胞环状DNA测序云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。技术优势：- 使用原装A&A biotechnology纯化柱高效富集环状DNA
- 滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率
- 专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表
云序生物eccDNA测序实验示意图
2.体液样品环状DNA测序针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。技术优势：- 减少DNA损失
- 保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确
3.体液样品环状DNA甲基化测序针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并, 同时在DN**段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。技术优势：一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高单碱基分辨的环状DNA甲基化分析4.环状DNA sanger测序针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的唯一总代理。-- 云序生物服务优势 --
优势一：国内首家提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司，同时也是首家有客户发表 10 分以上 eccDNA 论文的公司。优势二：环状DNA相关服务产品线最全的公司。优势三： A&A Biotechnology 总代理，采用原装A&A Bio纯化柱，环状DNA 纯化效果好。优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。 优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。往期eccDNA主题回顾福利包 | 一文看遍 2021 年 eccDNA 研究精华
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