使用喷墨打印固定浮游藻类孢子-技术前沿-资讯-生物在线

使用喷墨打印固定浮游藻类孢子

作者：上海睿度光电科技有限公司 2021-06-16T00:00 (访问量:8520)

Hwa-Rim Lee所在课题组通过将藻酸盐-孢子悬浮液打印到氯化钙溶液中来产生带有固定孢子的微粒，证明了喷墨打印具有固定藻类的巨大潜力，并且控制包囊孢子数量及其微环境的能力可以促进对包囊孢子微观相互作用的研究。

藻类细胞固定化是废水处理、有用代谢物生产和养殖管理的常用技术。然而，目前技术中对固定液滴的大小、微生物种群和生产率的控制需要改进。在这里，Hwa-Rim Lee所在课题组首次使用按需喷墨打印将海藻的孢子固定在海藻酸盐微粒中。通过将藻酸盐-孢子悬浮液打印到氯化钙溶液中来产生带有固定孢子的微粒。他们证明喷墨技术可以通过改变墨水中的孢子密度将喷射液滴中的孢子数量控制在0.23到1.87的范围内。在基于打印的孢子封装后，他们观察到菌体的初始发芽和持续生长，直到培养45天。该研究表明，喷墨打印具有固定藻类的巨大潜力，并且控制封装孢子数量及其微环境的能力可以促进对封装孢子微观相互作用的研究。

将藻类细胞固定在聚合物水凝胶中具有广泛的应用。固定化藻细胞可用于污水处理，以去除养分、金属和工业污染物。捕获的藻类细胞还可用于产生代谢物、测量毒性、通过冷冻保存细胞以及管理原种培养物。该技术还能够改善固定化藻细胞的代谢、功能和生长。在水凝胶颗粒中捕获微生物的方法包括将细胞悬浮液常规滴入装有硬化溶液的容器中；挤压滴水；重力驱动滴水；悬浮喷涂。所有这些方法要么速度慢，要么无法充分控制液滴的大小、微生物含量或生产率。一种实用的方法将克服这些缺点。

按需喷墨（DOD）喷墨打印广泛用于各种领域，如生物打印、印刷电子和3D制造。DOD压电喷墨打印在压电喷墨打印机的喷嘴通道中使用了一个压电致动器。电压脉冲会减少装有墨水的腔室的体积，因此有些会以液滴的形式喷出。压电喷墨打印可以在>10kHz下产生大小为1–100pL的液滴。喷射液滴的大小可以通过调整输入电压脉冲或选择合适的喷嘴来控制，并且小于水凝胶中营养物质和代谢物的扩散极限（100-200μm）。小尺寸的微粒可以使捕获的藻类细胞生长过程中的抑制作用最小化。由于能够喷射少量墨水，喷墨打印已被用于封装大分子、药物和哺乳动物细胞。

▲ 图1 钙离子与藻酸盐水凝胶交联的“鸡蛋盒”结构示意图

海藻酸盐是海藻和细菌生物膜中的主要多糖之一，是β-D-甘露糖醛酸（M嵌段）和α-L-古洛糖醛酸（G嵌段）的共聚物。藻酸盐可以在钙(Ca2+)或镁(Mg2+)离子存在下形成水凝胶。特别是藻酸盐中的G嵌段有助于形成强且可逆的交联网络，即所谓的“蛋盒结构”（图1）。由于独特的蛋盒结构，海藻酸盐已被用于化妆品、食品、生物医学/制药目的和锂离子电池中的各种涂层应用。由于海藻酸盐主要是从包括E.cava在内的微藻中分离出来的，因此选择海藻酸盐作为聚合物用喷墨打印技术固定E.cava孢子。本研究的目的是证明海藻酸盐喷墨印打印技术在固定腔孢藻孢子方面的能力。课题组测量了藻酸盐-孢子悬浮液的粘度并评估了液滴喷射和喷射特性的长期稳定性，以评估悬浮液的喷墨打印性。然后，他们监测液滴中的孢子数量以量化递送的可控性。最后对固定化孢子在PESI/GeO2培养基中的生长进行量化，以揭示藻类孢子固定化技术的兼容性。

材料与方法

海藻酸钠-孢子悬浮液制剂。海藻酸钠购自美国MP Biomedical LLC。从韩国济州岛海岸收集E.cava的生殖菌体，然后用冰盒运往实验室。用自来水清洗泰菌体以去除盐、沙子和微生物。收集包括孢子囊在内的菌体中间部分，并将碎片置于无菌海水中以释放孢子。使用脱脂棉过滤孢子悬浮液。来自褐藻（SigmaAldrich，美国）的2%(w/v)海藻酸钠溶液在120°C下高压灭菌20分钟，在室温下冷却并使用0.45µm注射器过滤器过滤。将溶液与孢子悬浮液混合以制备最终的0.5%(w/v)海藻酸钠溶液，浓度为0.125×10⁶、0.500×10⁶或2.00×10⁶个细胞ml^-1。

粘度测量。在室温下使用锥板旋转粘度计（DV2T，Brookfeld AMETEK，US）测量悬浮液的剪切粘度。粘度计有一个半径为2.4cm的旋转锥和一个固定板。将海藻酸钠-孢子悬浮液（0.5ml）置于板和锥体之间。剪切速率介于50s⁻¹和1,500s⁻¹之间，持续60s；粘度是通过最后10秒（n=3）的平均老化数据得出的。

海藻酸钠-孢子悬浮液的喷墨打印。使用DOD喷墨打印系统（Jetlab II，MicroFab Technologies，Inc.，USA）打印海藻酸钠-孢子悬浮液。使用直径为80µm的压电喷墨喷嘴，并在双极模式下以±80V施加电压脉冲。波脉冲的上升时间为6.0µs，停留时间为13µs，下降时间为9.0µs，回波时间为22µs。打印系统中配备的频闪CCD相机和短时LED灯每30微秒获取一次喷射形成的图像。在载玻片上生成打印的海藻酸钠孢子悬浮液阵列。阵列的液滴间距为400μm，载物台速度为50mms⁻¹。在光学显微镜下观察打印的阵列并计算每滴孢子的平均数（n=30）。

孢子固定化藻酸盐微粒的制备和培养。使用喷墨打印系统打印海藻酸钠-孢子悬浮液，将打印的液滴收集在35毫米培养皿中，该培养皿中含有1%（w/v）溶解在海水中的CaCl2。海水已在120°C下高压灭菌20分钟，在室温下冷却并通过0.45µm过滤器。打印以1,000Hz的喷射频率进行30分钟。使用1厘米长的磁力搅拌棒搅拌溶液以防止水凝胶颗粒聚集。打印后，将70μl产生的微粒悬浮液与200μl补充有GeO2的PESI培养基混合，并输送到96孔板的每个孔中。样品在15°C、30μmolm^-2s^-1的光强度和10小时光照：14小时黑暗的日光周期下孵育。在培养的第3、8、14和21天，在显微镜下测量E.cava配子体的总长。根据所使用的海藻酸钠溶液浓度为0.125×10⁶、0.500×10⁶或2.00×10⁶个细胞ml^-1不同，E.cava的配子植体的测量数量不同。(n0.125=7,n0.500=15,n2.00=20)

▲ 图2 基于压电喷墨打印技术生成孢子固定微粒的系统示意图

所有定量数据均表示为平均值±标准偏差。使用Origin 2016（美国马萨诸塞州Origin实验室）进行单向方差分析（ANOVA）和Bonferroni后分析。p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果与讨论

孢子固定化藻酸盐微粒的制备策略。图2说明了用于生成含有孢子的海藻酸盐微粒的饼状压电按需喷墨打印系统。当向喷墨喷嘴的压电致动器施加电压脉冲时，喷嘴会喷射出一系列海藻酸钠-孢子悬浮液的皮升液滴，这些液滴沉入容器中的CaCl2溶液中。一旦液滴撞击溶液表面，Ca2+就会进入海藻酸盐分子的古洛糖酸盐块，从而与相邻的古洛糖酸盐块形成连接。结果，基于藻酸盐的液滴被交联并转化为包裹孢子的水凝胶微粒。将容器中的溶液磁力搅拌以防止水凝胶颗粒聚集（补充图1）。

海藻酸钠-孢子悬浮液的粘度和射流形成。在5×10¹和10³s^-1之间的剪切速率范围内测量海藻酸钠-孢子悬浮液的粘度，以检查其可打印性。所有悬浮液的粘度都<20mPa∙s，这对于稳定打印来说是适当的低（图3a）。由于孢子非常小（几微米）和低范围的孢子密度（0.125×10⁶ml^-1到2.00×10⁶ml^-1），孢子密度对粘度没有显着影响。然后，课题组观察了它们的喷射行为2小时。在实验过程中没有观察到喷嘴堵塞。他们的射流形成的代表性高速图像如图3b所示。在相同的驱动波形和可忽略不计的剪切粘度差异下，观察到液滴速度随着孢子密度的增加而降低。他们推测悬浮液内的E.cava孢子自然分泌的成分可能会略微增加墨水的弹性。

▲ 图3 (a)不同E.cava孢子密度的海藻酸钠-孢子悬浮液的粘度

(b)由相同输入电压驱动的射流形成图像（插图）

每滴平均孢子数。为了量化孢子传递的可控性，课题组通过将海藻酸钠-孢子悬浮液的点阵打印到玻璃基板上而不交联来研究液滴中的孢子数量。然后，使用显微镜计算液滴中的孢子数（图4a，b）。点阵检查显示，随着孢子密度的增加，每滴孢子的平均数量增加：0.125×10⁶ml^-1时为0.23，0.500×10⁶ml^-1时为0.67，2.00×10⁶ml^-1时为1.87（图3）。4f），随着孢子密度的增加，点的大小减小（图4c-e）。然而，每滴的平均孢子数没有像悬浮液的孢子密度那样增加。孢子种群可能增加了悬浮液的粘度和弹性，并减少了喷嘴的墨水喷射量，这在之前的研究中也观察到。控制封装孢子数量及其微环境的能力表明，压电喷墨打印技术可能用作研究封装孢子微观相互作用的方法。

▲ 图4 打印点阵图案以计算每个液滴的平均孢子数。点阵的显微镜图像，放大倍数为20x(a)和40x(b)。具有0.125×10⁶个细胞ml^-1(c)、0.500×10⁶个细胞ml^-1(d)和2.00×10⁶个细胞ml^-1(e)的海藻酸钠-孢子悬浮液点的代表性图像。玻璃基板上喷射液滴的尺寸约为200μm(c)、150μm(d)和130μm(e)。白色箭头表示孢子。(f)与孢子密度相关的每个液滴的实验和计算平均孢子数（*p<10-4，**p<10-5与在2.00×10⁶个细胞ml^-1处获得的值相比）。

固定在藻酸盐微粒中的E.cava孢子的产生和培养。微粒是使用喷墨打印系统产生的，容器中装有CaCl2交联溶液，如图2所示。为了监测载有孢子的微粒的形态，使用显微镜观察它们。E.cava的孢子固定在藻酸盐微粒内（图5，白色箭头）。藻酸盐与钙离子的交联从打印液滴的边界快速进行，在此过程中不考虑孢子的损失，并且预期的包囊孢子数量与图4中的相同。固定在内部的孢子数量微粒随着悬浮液的孢子密度增加而增加。由于磁力搅拌器的剧烈搅拌，形成的微粒形状为椭圆形。

▲ 图5 不同孢子密度的孢子固定微粒显微图像

▲ 图6 (a)固定在具有不同孢子密度的藻酸盐微粒中的E.cava配子体的代表性图像

(b)固定在藻酸盐微粒中的E.cava配子体的距骨长度

对捕获的孢子的突出和生长进行了45天的监测，以证明藻类孢子固定技术的兼容性。固定在微粒中的孢子保持休眠状态直到第8天（图6），然后叶状体开始生长。第14天的平均菌体长度达到~10µm，第21天达到~30µm。培养45天后，E.cava显示出灌木状形态。由于孢子是从孢子体中收集的，因此生长中的E.cava显示出配子体表型。结果表明，喷墨打印可用于固定藻类细胞。此外，生长趋势不受孢子密度的显着影响。结果表明，水凝胶微粒内低至中等密度的E.cava孢子不会显着影响彼此的叶绿体形态。发生这种影响的孢子密度范围应在未来的研究中确定。

结论

在这项研究中，压电喷墨打印技术用于将E.cava孢子固定在海藻酸钠悬浮液中。粘度和液滴形成行为表明它们是适合喷墨打印的材料。孢子的空间密度可能会影响海藻酸钠-孢子悬浮液的粘度和弹性，从而影响喷射形成和低于预期的平均每液滴孢子数。打印技术允许制造孢子固定的藻酸盐微粒。微粒的培养产生了健康的E.cava配子体，而对孢子密度没有显着依赖性。这些结果表明，喷墨打印可用于固定藻类细胞和单细胞封装。

参考文献：

[1] Lee H R , Sang M J , Yoon S , et al. Immobilization of planktonic algal spores by inkjet printing[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1):1-7.

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